Larry Daley (Ben Stiller) es un soñador que ha tenido poca suerte en la vida, sus inventos nunca le han dado buenos resultados y decide hacerse cargo del turno de noche en la vigilancia del Museo de Historia Natural en donde trabaja Cecil Fredricks (Dick Van Dyke), el vigilante que se va a jubilar y que dejará su puesto a Larry.

El trabajo parece que no va a tener demasiado peligro y decide aceptarlo a regañadientes. En su primera noche hace la ronda tan sólo con el folleto en donde le dice qué debe vigilar y una linterna enorme. Comienza la ronda de noche solo, acompañado tan sólo del silencio de un museo en donde no hay nadie pero, de pronto, comienza a escuchar varios ruidos. De pronto, cuando se acerca a algo que parece moverse, se da cuenta de que uno de los esqueletos de los dinosaurios del museo ha vuelto a la vida y está bebiendo agua de uno de los dispensadores del museo.

Aterrorizado, Larry intenta huir pero se da cuenta de que todas y cada una de las criaturas del museo vuelven a la vida, pero no sólo las criaturas prehistóricas, sino los personajes como Atila, el rey de los hunos, que como se dice por donde pasa no crece la hierba, y hace realidad el dicho: comienza a destruir el museo acompañado de los traviesos monos y los fieros leones. De pronto, Teddy Roosevelt (Robin Williams) acepta ayudarlo para no sólo conseguir sobrevivir a todo lo que pasa a su alrededor, sino también salvar el museo y darle un buen ejemplo a su hijo.

La película hará las delicias de todos aquellos fans de Ben Stiller, que en Noche en el museo está en su salsa, haciendo reír a todos con sus desmadres. Por supuesto, tendremos a toda una serie de cómicos al servicio de este filme de Shawn Levy, comenzando por los nombrados Robin Williams y Ben Stiller, pero siguiendo con el omnipresente en las películas de Stiller, Owen Wilson, con Mickey Rooney, Ricky Gervais o con Steve Coogan.